Перейти
на сайт журнала "Врач" |
Перейти на сайт журнала "Медицинская сестра"
|
Перейти на сайт журнала "Фармация"
|
Перейти на сайт журнала "Молекулярная медицина"
|
Перейти на сайт журнала "Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии"
|
Журнал включен в российские и международные библиотечные и реферативные базы данных
ВАК (Россия)
|
РИНЦ (Россия)
|
Эко-Вектор (Россия)
|
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЖЕЛТОЙ СОЛИ ТЕТРАЗОЛИЯ В ФОРМАЗАН В КЛЕТКАХ HeLa
DOI: https://doi.org/10.29296/25877313-2023-11-08
Номер журнала:
11
Год издания:
2023
Актуальность. МТТ-тест является одним из наиболее распространённых методов определения цитотоксического действия экстрактов растений и их индивидуальных соединений. Несмотря на обширное применение этого метода, остаётся неясным, разрушают ли кристаллы МТТ-формазана плазматическую мембрану клеток при восстановлении МТТ в МТТ-формазан; происходит ли потеря формазанового продукта в случае разруше-ния клеток в процессе проведения исследования цитотоксического действия методом МТТ.
Цель исследования – изучение преобразования МТТ в МТТ-формазан в клетках HeLa методами микроскопии и спектрофотометрии, а также определение возможности потери формазанового продукта при исследовании цитотоксического действия природных и синтетических соедине-ний методом МТТ.
Материал и методы. Клетки HeLa высевали на покровные стекла в бюксах, инкубировали с раствором МТТ (в конечных концентрациях 0,1 и 0,5 мг/мл), изучали при помощи световой микроскопии через 30, 60, 120 и 240 мин после добавления МТТ. При исследовании методом спектрофо-тометрии, в 96-луночный планшет вносили клетки (5×104 к/лунку), добавляли раствор МТТ и инкубировали в течение 30, 60, 120 и 240 мин, ре-гистрировали спектры поглощения МТТ и МТТ-формазана при помощи планшетного спектрофотометра.
Результаты. Исследование методом микроскопии показало две фазы в преобразовании МТТ клетками в МТТ-формазан – образование гранул и образование кристаллов МТТ-формазана. Максимальное соотношение кристаллов к гранулам МТТ-формазана, а также практически полное раз-рушение клеток наблюдали на 240-й мин инкубации методом световой микроскопии. Однако при исследовании методом спектрофотометрии, по-сле разрушения клеток диметилсульфоксидом, значения оптической плотности раствора МТТ-формазана через 120 мин инкубации и через 240 мин инкубации были практически одинаковыми. Следовательно, преобразование МТТ-формазана из гранул в кристаллы не влияет на результаты определения оптической плотности, несмотря на разрушение клеток. Культуральная среда без клеток не восстанавливает МТТ в МТТ-формазан. В супернатанте от клеток без их разрушения также не наблюдалось значительного количества МТТ-формазана.
Выводы. Кристаллы МТТ-формазана не растворяются в культуральной среде и растворяются в диметилсульфоксиде. В связи с этим разруше-ние клеток не приводит к потере формазанового продукта при восстановлении МТТ в формазан и не влияет на результаты определения цитоток-сического действия.
Ключевые слова:
HeLa
МТТ
формазан
гранулы формазана
кристаллы формазана
световая микроскопия
спектрофотометрия.
Для цитирования:
Сёмушкина А.Ю., Кабанов Д.С. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЖЕЛТОЙ СОЛИ ТЕТРАЗОЛИЯ
В ФОРМАЗАН В КЛЕТКАХ HeLa
. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2023; (11): 47-https://doi.org/10.29296/25877313-2023-11-08
Список литературы:
- Braissant O., Astasov-Frauenhoffer M., Waltimo T., Bonkat G. A review of methods to determine viability, vitality, and meta-bolic rates in microbiology. Frontiers in Microbiology. 2020; 11: 547458.
- Riss T., Moravecs R., Niles A., Duellman S., Benink H., Wor-zella T., Minor L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual [Internet]. 2016; 1–25.
- Ghasemi M., Turnbull T., Sebastian S., Kempson I. The MTT assay: utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International journal of molecular sciences. 2021; 22 (23): 12827.
- Stockert J.C.; Horobin R.W.; Colombo L.L.; Blázquez-Castro A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochem. 2018; 120: 159–167.
- Bernas T., Dobrucki J. The Role of Plasma Membrane in Bioreduction of Two Tetrazolium Salts, MTT, and CTC Arch. Biochem. Biophys. 2000; 380: 108–116.
- Bernas T., Dobrucki J.W. Backscattered light confocal imaging of intracellular MTT‐formazan crystals. Microscopy research and technique. 2004; 64 (2): 126–134.
- Fisichella M., Dabboue H., Bhattacharyya S., Saboungi M. L., Salvetat J. P., Hevor T., Guerin M. Mesoporous silica nanopar-ticles enhance MTT formazan exocytosis in HeLa cells and astrocytes. Toxicology in vitro. 2009; 23 (4): 697–703.
- Molinari B.L., Tasat D.R., Palmieri M.A., Cabrini R.L. Kinetics of MTT-formazan exocytosis in phagocytic and non-phagocytic cells. Micron. 2005; 36 (2): 177–183.
- Lü L., Zhang L., Wai M. S. M., Yew D. T. W., Xu J. Exo-cytosis of MTT formazan could exacerbate cell injury. Toxicology in vitro. 2012; 26 (4): 636–644.
- Liu Y., Peterson D. A., Schubert D. Amyloid β peptide alters intracellular vesicle trafficking and cholesterol homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1998; 22: 13266–13271.