ВЫЯВЛЕНИЕ РНК SARS-COV2 С ПОМОЩЬЮ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ ПЕТЛЕВОЙ АМПЛИФИКАЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ МЕТОДОМ АНАЛИЗА КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ

DOI: https://doi.org/10.29296/25877313-2020-12-01
Номер журнала: 
12
Год издания: 
2020

И.П. Оскорбин к.б.н., мл. науч. сотрудник, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) Г.Ю. Шевелёв к.х.н., зав. лабораторией, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) E-mail: osc.igor@gmail.com К.А. Проняева лаборант, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) А.А. Степанов к.м.н., зав. лабораторией, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) Д.В. Пышный д.х.н., чл.-корр. РАН, директор института, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) М.Л. Филипенко к.б.н, зав. лабораторией, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск)

Актуальность. В связи с продолжающейся пандемией COVID-19, вызванной коронавирусом SARS-CoV2, существует острая потребность в диа-гностических тестах для выявления РНК вируса SARS-CoV2. Наиболее широко используемый метод ОТ-ПЦР позволяет получить результаты те-стирования в течение 1,52 часов. Вместе с тем в связи с нехваткой пропускной способности диагностических лабораторий представляется не-обходимой разработка более быстрых методов тестирования. Цель исследования. Создание метода выявления РНК коронавируса SARS-CoV2 с помощью мультиплексной изотермической петлевой ампли-фикации (LAMP) с обратной транскрипцией посредством анализа кривых плавления. Материал и методы. В качестве стандартных образцов использовали сконструированную плазмиду с фрагментом генома SARS-CoV2 и фага MS2, фрагменты геномной РНК SARS-CoV2 и фага MS2. Клинические образцы (назофарингеальные мазки), получали от пациентов ЦНМТ ИХБФМ СО РАН; РНК выделяли с помощью набора «РИБО-преп» ЦНИИ Эпидемиологии (Москва, Россия). LAMP проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad; США). Аналитические характеристики LAMP определяли с помощью разведений стандартных образцов. Клиническую чувствительность и специ-фичность мультиплексной LAMP оценивали, проводя тестирование клинических образцов одновременно LAMP и ОТ-ПЦР. Результаты. Подобраны праймеры и оптимизированы условия для проводения детекции с помощью LAMP участков РНК SARS-CoV2 и фага MS2, который служил внутренним контролем выделения РНК и амплификации. Мультиплексирование было основано на анализе кривых плавления продуктов амплификации. Предел чувствительности мультиплескной LAMP составил 20 молекул РНК SARS-CoV2 на реакцию. Конкордантность ре-зультатов тестирования 40 клинических образцов сравнительно с ОТ-ПЦР в реальном времени составила 92%. Выводы. Разработан метод для выявления РНК коронавируса SARS-CoV2 на основе мультиплексной изотермической петлевой амплификации. Метод, основанный на мультиплексной LAMP, может быть использован как альтернатива ПЦР в диагностической практике для экономии машин-ного времени и времени персонала.

Ключевые слова: 
SARS-CoV2
коронавирус
изотермическая петлевая амплификация
LAMP
мультиплексная амплификация

Список литературы: 
  1. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63.
  2. Yongkiettrakul S., Kampeera J., Chareanchim W. et al. Simple detection of single nucleotide polymorphism in Plasmodium falciparum by SNP-LAMP assay combined with lateral flow dipstick. Parasitol. Int. 2017; 66(1): 964–971.
  3. Global Tuberculosis Programme. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis : policy guidance. 38 p.
  4. Guo X.G., Zhou Y.Z., Li Q. et al. Rapid and reliable diagnostic method to detect Zika virus by real-time fluorescence reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. AMB Express. Springer Verlag. 2018; 8(1).
  5. Poon L.L.M., Leung C.S., Chan K.H., et al. Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(1): 427–430. Park G.S., Ku K., Baek S.H. et al. Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J. Mol. Diagnostics. Elsevier B.V. 2020; 22(6): 729–735.
  6. Kitagawa Y., Orihara Y., Kawamura R. et al. Evaluation of rapid diagnosis of novel coronavirus disease (COVID-19) using loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Virol. Elsevier B.V. 2020; 129.
  7. Dong J., Xu Q., Li Ch. et al. Single-color multiplexing by the integration of high-resolution melting pattern recognition with loop-mediated isothermal amplification. Chem. Commun. Royal Society of Chemistry. 2019; 55(17): 2457–2460.
  8. Xu G., Gunson R.N., Cooper J.M., Reboud J. Rapid ultrasonic isothermal amplification of DNA with multiplexed melting analysis-applications in the clinical diagnosis of sexually transmitted diseases. Chem. Commun. Royal Society of Chemistry. 2015; 51(13):2589–2592.
  9. Corman V., Landt O., Kaiser M. et al. Diagnostic detection of Wuhan coronavirus 2019 by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25(3): 2000045. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.